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什么是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法

更新時間:2024-03-21點擊次數(shù):968
  脂質(zhì)體作為體內(nèi)和體外輸送載體的工具,已經(jīng)研究的十分廣泛,中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA,借助脂質(zhì)膜將DNA導入細胞膜內(nèi)。帶正電的陽離子脂質(zhì)體,DNA并沒有預先包埋在脂質(zhì)體中,而是帶負電的DNA自動結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上,形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復合物,從而吸附到帶負電的細胞膜表面,經(jīng)過內(nèi)吞被導入細胞。與其它方法相比,有較高的效率和較好的重復性,它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中,是目前條件下方便的轉(zhuǎn)染方法之一。
  脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作步驟
  進行實驗之前,請先規(guī)劃好實驗,一般細胞轉(zhuǎn)染需要24h-72h,所以要充分了解細胞生長速度,計算所需脂質(zhì)體和DNA的儲備量,并確認準備好所需試劑:Opti-MEM無血清培養(yǎng)基,Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑,以及DNA,這個一定要確認好。
  1、細胞鋪板
 ?。?)一般會選擇復蘇細胞傳代3-4次(匯合率達到90%之前對細胞進行傳代,不要長到100%),從解凍過程中恢復過來可以穩(wěn)定生長的細胞進行細胞轉(zhuǎn)染,傳代次數(shù)高(>30-40)時,細胞的生長速度和形態(tài)會改變。
 ?。?)如果提總蛋白,一般選擇六孔板進行轉(zhuǎn)染,因為轉(zhuǎn)染的細胞提取蛋白的總量能達到200ug,一般夠做并且需要的DNA和Lipofectamine又相對比較少。
 ?。?)傳代條件取決于所用的細胞系。對于快速生長的細胞,倍增時間為16小時(如HEK293)。對于生長緩慢的細胞,倍增時間為36小時(如原代細胞)。
 ?。?)轉(zhuǎn)染當天,將細胞鋪板。如果在轉(zhuǎn)染前一天或更早時間鋪板,轉(zhuǎn)染效率可能下降,如果是簡單細胞系的轉(zhuǎn)染,可以直接在前一天晚上鋪板,第二天來轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時,細胞密度會影響轉(zhuǎn)染效率,細胞密度保持在匯合率為70-90%(這個前提是轉(zhuǎn)染24h,如果轉(zhuǎn)染48h則需要匯合率為50-70%),細胞的鋪板和轉(zhuǎn)染也可同時進行。
  2、細胞轉(zhuǎn)染
  吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基,用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。更換無血清培養(yǎng)基。準備轉(zhuǎn)染制備液,用滅菌后的EP管制備。以六孔板為例,A液:用200μl Opti-MEM稀釋4μg質(zhì)粒;B液:用200μl Opti-MEM稀釋10μl lipo2000,分別將A液、B液輕輕混勻,靜置5min,吸取B液加入至A液中,輕輕混勻,室溫靜置20min。加入轉(zhuǎn)染試劑到每個孔的培養(yǎng)基中,6h后,更換成完q培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)到24-48小時(不同的質(zhì)粒和脂質(zhì)體最佳搭配比例不同,轉(zhuǎn)染前,應(yīng)該摸一個最佳配比。質(zhì)粒:脂質(zhì)體=1:1,1:1.5,1:2,1:2.5,1:3,1:3.5的梯度比例來檢測最佳轉(zhuǎn)染比例,一般質(zhì)粒有帶熒光,可以通過觀察每組熒光強弱來判斷轉(zhuǎn)染效率)。以下為不同規(guī)格的培養(yǎng)板需要加DNA和lipo2000的量。
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